Have drug hunters finally cracked KRas?

化学家凯文·肖卡特 (Kevan Shokat) 第一次获得线索的那一刻，他的加利福尼亚大学旧金山分校实验室的科学家正在破解最臭名昭著且难以捉摸的致癌蛋白质之一。

那是 2011 年 12 月，当他收到一位博士后 ​​Ulf Peters 的电子邮件时，他正在去太浩湖的路上大雪纷飞。该消息仅包含一列数字。但 Shokat 知道，当输入特殊软件时，这些数字将转化为与 KRas 结合的小分子的三维图像，KRas 是一种蛋白质家族成员，在 30% 的癌症中发生了突变，几十年来一直阻碍着药物开发人员。那些神秘的数字是多年艰苦努力、常常令人沮丧的工作的结晶。

Shokat 真的需要使用电脑。

但首先，他必须走出暴风雪。“我迫不及待地想要到达那里，而汽车就是无法上山，”他回忆道。最后，他找到了一台电脑并下载了图像。肖卡特将他所看到的描述为“简直令人难以置信”。

Shokat 的实验室设法在 KRas 的突变形式上找到了一个新的、尽管很浅的口袋，这种突变形式已知是肺癌的驱动因素。3-D 图像允许他实验室的化学家调整小分子以更好地装入口袋，并最终设计出第一个蛋白质共价抑制剂。

在那个突破性的时刻，Shokat 被困在山腰上是合适的：KRas 被许多药物开发商认为是珠穆朗玛峰的目标。

KRas 突变在癌症中的普遍性使其成为最理想的药物靶点之一，但它也是最难解决的靶点之一。尽管进行了数十年的工作，研究人员仍然缺乏有关蛋白质表面在移动和与其配体相互作用时是什么样子的详细信息。这使得寻找小分子可以滑入的裂缝就像试图在蒙住眼睛的情况下攀登陡峭的山峰一样。

Shokat 的研究是围绕 KRas 活动复苏的一部分。有了新的想法和尖端技术的帮助，科学家们认为他们最终将能够解决这个目标。新发现的信心催生了多家致力于 KRas 抑制的生物技术公司。自 2012 年以来，专利申请激增，当时 Shokat 和其他科学家开始报告可以（如果只是微弱）抑制蛋白质的小分子。

但随着围绕 KRas 的药物发现工作的激增，现实主义也随之而来。药物开发人员一反常态地对眼前的任务感到谦卑。Nimbus Therapeutics 的首席科学官 Rosana Kapeller 说：“这需要很大的毅力和韧性。” “这个目标一直是一个墓地，所以我们希望在如何接近它时非常聪明，这样我们就不会遭受同样的命运。”

一个纯粹的高峰

在过去的二十年里，大多数小分子都开发用于治疗癌症靶向蛋白激酶，即将磷酸基团附着在其他蛋白质上的酶。激酶成为很好的靶点不仅因为它们与癌症有关——已知特定激酶的突变会推动某些肿瘤的生长——而且因为它们是“可成药的”。大多数激酶在停靠在结合口袋中时从核苷酸三磷酸腺苷 (ATP) 中获得磷酸基团。当 ATP 不在家时，一个小分子可以方便地进入，关闭激酶的活性。

相比之下，Ras 家族（包括 KRas、NRas 和 HRas）的活性由开启它的三磷酸鸟苷 (GTP) 和关闭它的鸟苷二磷酸 (GDP) 决定。ATP 在激酶的结合口袋中进出，而 GTP 和 GDP 像胶水一样粘在 KRas 上。

“有了 Ras，整个蛋白质会围绕 GTP 或 GDP 折叠起来，”加州大学旧金山分校癌症研究员 Frank McCormick 解释说。它们的吸引力是如此之大，以至于只需要少量的配体就可以锁定 Ras。药物猎人一直无法找到可以将配体赶出家门的分子。

由于这条途径被封锁，药物开发人员的下一个明显策略是在 KRas 上寻找其他小分子可以结合并改变其活性的口袋。但是有一个问题：这种酶非常光滑，以至于研究人员将其比作台球。已发现的少数替代口袋很浅，并且已证明几乎不可能设计出可以与蛋白质形成牢固结合的小分子。在 1990 年代，科学家们专注于阻断法呢基转移酶的化合物，这是一种向 Ras 添加脂质尾的酶，使其能够钩入细胞膜。该策略在老鼠身上发挥了巨大作用，大型制药公司开发的一些法呢基转移酶抑制剂使其进入了人类的后期研究。他们都失败了。事实证明，KRas 有一种获得脂质尾巴的备用方法。

这些失败发生在基因组学揭示激酶中致癌突变的时候，研究人员在很大程度上继续前进。但是今天，药物开发人员已经没有激酶可追了，他们也认识到激酶靶向疗法的局限性。“新激酶靶点的时代已经结束，”加州大学旧金山分校的麦考密克说。“现在，我认为大多数公司都对免疫疗法和 Ras 感兴趣。”

值得庆幸的是，激酶疲劳与解决 KRas 的创新策略相吻合。“在 KRas 上工作了两三年，已经耗尽了大多数人的最佳想法，”Nimbus 的首席执行官唐尼科尔森说。“但大多数人最好的想法来自 2000 年或更早。我们拥有全新的技术能力。”

一个立足点

近十年来，Shokat 一直在考虑如何瞄准 KRas，最后才为该项目投入资源。从 1990 年代后期加入加州大学旧金山分校的那一天起，他的同事、Ras 生物学领域的巨头麦考密克就一直缠着他研究 KRas 抑制剂。

最后，在 2008 年，Shokat 让一些学生致力于开发抑制 KRas 的化合物。Shokat 的团队专注于 G12C，这是 KRas 的一种突变形式，在第 12 个氨基酸处用半胱氨酸代替甘氨酸，是肺癌的常见驱动因素。在几种策略失败后，研究人员决定针对同事的“束缚”分子库（会与半胱氨酸残基发生反应的小化学片段）筛选突变蛋白。

当屏幕产生一些点击时，他们很高兴，更鼓励发现两个最好的片段没有影响正常的 KRa。对突变蛋白的这种选择性有助于最大限度地减少使用束缚方法最终开发的任何药物的副作用。

研究人员花了六个多月的时间试图优化化合物，但没有晶体结构，他们在黑暗中工作。Shokat 说，他在 2011 年底在山腰收到的数据正是他的实验室需要的推动力：他们揭示了一个以前未知的变构位点，并使化学家能够改进该化合物。他们在优化分子、解决晶体结构和测量化合物活性的循环中花费了更多的时间。

2012 年，这些早期抑制剂成为 Wellspring Biosciences 的基础，这是一家生物技术公司，由组建 Shokat 之前的公司 Intellikine 的同一团队创立。强生公司于明年年初获得了该计划的许可。

Shokat 的共价抑制剂于 2013 年末发表，尽管每个人都对他的化学奇才印象深刻，但也有人担心。当突变蛋白处于非活性状态时，这些化合物会与突变蛋白结合，但并非所有人都相信这会转化为临床益处。

在与潜在合作伙伴的会谈中，“人们总是说，'是的，你向我们展示了一个大而美丽的晶体结构，但它在生物学中有什么作用？' ” Wellspring 首席科学官 Yi Liu 回忆道。更令人怀疑的是，Shokat 最好的初始分子并没有以药物所需的效力与 KRas 结合。

Wellspring 研究人员解决了这个问题，并设法制造出效力高达 1,000 倍的化合物。研究人员后来证明，他们的 KRas 抑制剂阻断了来自蛋白质的信号传导，并阻止了具有 G12C 突变的细胞的生长。

计算登山者

在 Shokat 发表他的工作并且 Wellspring 将他的化合物授权给强生公司的一年前，另外两个实验室报告了与 KRas 上不同浅口袋结合的分子。

基因泰克科学家和范德比尔特大学的 Stephen Fesik 都使用核磁共振来识别与 KRas 相互作用的化学碎片。然后他们要么优化这些片段，要么将它们拼接成分子，这些分子落在相邻的点上并增加整体结合强度。Fesik 在 1990 年代后期在 Abbott Laboratories 工作期间开创了基于 NMR 的药物设计方法，并且它已被证明是寻找困难目标抑制剂的好方法。

不幸的是，加州大学旧金山分校的麦考密克指出，基因泰克和 Fesik 实验室的分子都没有被证明能够关闭 KRas。Fesik 继续寻找关闭蛋白质的方法。

但这项研究和 Shokat 的研究确实为其他有兴趣追求 KRas 的人揭示了关键的结构见解和工具化合物。一方面，Nimbus 认为科学和技术都已经发展到足以为 KRas 投入资源。大约 18 个月前，Nimbus 与其合作伙伴 Schrödinger（计算化学领域的领导者）开始研究 KRas。

基于计算机的方法以前曾在 KRas 等棘手的目标上尝试过，但今天的不同之处在于，计算化学家现在认识到他们的重点需要扩展到 3-D 结构洞察、量子物理学和分子相互作用之外，以包括基于时间的运动的蛋白质。

“它有点像果冻，”尼科尔森说。“有不断的运动，其他小分子会改变结构。为了使计算化学可用，你必须以数学方式预测这些事情。”

Nimbus 正试图将这种运动融入其 KRas 计划中。这项工作已经在酶上产生了四个所谓的“神秘”结合位点——只有当 KRas 弯曲和弯曲时才会显露出来。Nimbus 现在将计算化学与基于 NMR 的技术和晶体学相结合，以寻找与这些位点结合的化合物。“那容易吗？” 卡佩勒问道。“不，这并不容易。”

Nimbus 还试图利用天然产物与 Ras 等坚韧蛋白质结合的能力。目标不是将天然产物用作药物，而是研究它们如何与蛋白质结合，并将这种相互作用的关键元素整合到从头开始构建的分子中。该方法在 Nimbus 的其他项目中被证明是有效的，特别是在乙酰辅酶 A 羧化酶变构抑制剂的设计中，这些化合物最近被吉利德科学公司授权用于治疗脂肪肝。

由于 KRas 是一项巨大的挑战，Nimbus 正在寻找能够带来互补专业知识的合作者。Nicholson 表示，该公司希望在明年初之前为其 KRas 项目争取到一个合作伙伴。

哥伦比亚大学化学家 Brent Stockwell 也依靠计算化学来设计阻断 Ras 的小分子。知道药物开发人员长期以来一直受制于蛋白质的浅口袋，斯托克韦尔决定通过寻找两个而不是一个立足点来增加结合强度。使用计算药物设计，Stockwell 将分子对接到相邻的口袋中，然后将它们连接起来以创建 KRas 的非共价抑制剂。

这些化合物是从哥伦比亚分拆出来的一家名为 Kyras Therapeutics 的公司，该公司最近在纽约市开设了实验室。投资公司 Versant 的合伙人 Carlo Rizzuto 说：“布伦特计划的真正独特之处在于，他不仅开发了这些分子，而且将它们用于体内，”这表明它们在小鼠体内具有合理的药代动力学特性和活性。 Kyras 的风险投资公司和首席执行官。“我不知道有多少 Ras 抑制剂能做到这一点。”

Kyras 现在正在建立新实验室，同时其科学家正在努力提高其初始化合物的效力和其他特性。

另一个立足点

大约在 Shokat 开始研究 Ras 的时候，另一位著名的化学家 Greg Verdine 正在考虑使用小分子抑制 KRas 等“扁平”蛋白质的新方法。人类生物学提供了几个例子，其中天然产物只能在细胞内蛋白质的帮助下才能阻断其目标。最突出的例子是天然产物雷帕霉素，它通过与 FKBP 形成三元复合物与 mTor 结合，FKBP 是一种遍布全身的蛋白质折叠伴侣。

2012 年，Verdine推出了 Warp Drive Bio，目的是寻找他所谓的小分子辅助受体靶向药物或 SMART 药物。这个想法是设计化合物，作为两种天然存在的蛋白质——FKBP 和一个平坦的药物靶点之间的魔术贴。

KRas 提出了最终的平面目标挑战，而 Warp Drive 的科学家们在过去两年中一直试图组装分子，在 FKBP 的帮助下，阻止它。2014 年 10 月，Warp Drive 研究人员在幸福的拥抱中捕捉到了他们的第一个小分子 KRas 和 FKBP 的晶体结构。此后，该团队每两到三个月就提出其他三元复合物的新晶体结构，包括活性（GTP 绑定）和非活性（GDP 绑定）形式的 Ras 结构。

Verdine 说，该项目产生了惊喜。例如，当 KRas 的三元复合物处于活性形式时，小分子只是一个锚，相互作用主要是两种蛋白质之间的相互作用。同时，KRas 的非活动形式使用完全不同的位置与 FKBP 交互。

今年 1 月，自 Warp Drive 成立以来的投资者赛诺菲同意共同开发针对三种不同 Ras 突变体的药物。Warp Drive 的化学家现在正在研究四种化学支架，目标是在 2018 年底之前将 KRas 靶向药物推向临床。

Verdine 并不是唯一一位受到自然界中发现的三元复合物的治疗潜力启发的科学家。俄亥俄州立大学研究员 Roger Briesewitz 在斯坦福大学 Gerald Crabtree 实验室担任博士后期间致力于推广三元复合物的概念，他与俄亥俄州立大学化学家 Dehua Pei 合作测试具有识别 FKBP 的部分的肽是否可以夹在它之间和克拉斯。

尽管两人确实发现了一些通过形成三元复合物来关闭 Ras 的肽，但他们惊讶地发现似乎不需要 FKBP 与 Ras 结合的肽。Pei 构建了一个取代该部分的环肽库，您瞧，这些肽被证明可以阻断多种形式的 Ras。

Briesewitz 与合同研究组织 Evotec 合作进一步开发该计划。由于肽的药代动力学特性很差，合作伙伴使用它们来了解它们如何与 KRas 结合。Briesewitz 现在希望利用这些结构信息来设计针对目标的小分子。

充满挑战的路线

还有一些人相信有一种方法可以直接靶向 KRas 上的活性结合位点。2013 年，哈佛大学化学生物学家 Nathanael Gray 领导的团队报告了 G12C 突变体的选择性、直接作用共价抑制剂的开发。他们的两个分子——一种 GDP 类似物及其前药衍生物——标志着科学家们第一次能够不可逆地靶向蛋白质的活性位点。

这项工作是对科学纲要的一个可爱的补充，但这些化合物有一个关键的缺陷：它们不容易滑入细胞内。该团队现在正在寻找具有细胞渗透性的小分子。

德克萨斯大学西南医学中心助理教授 Ken Westover 说，这是一条艰难的道路，他在格雷实验室担任博士后期间在寻找 GDP 模拟方面发挥了关键作用。第一步是寻找可以在活性位点结合的化合物，这对合作伙伴来说意味着寻找类似 GDP 的化合物，以保留天然配体的一些相互作用，或者寻找全新的化合物。但继续与格雷合作的韦斯托弗承认，这种方法“在技术上很困难”。此外，这些类似 GDP 的化合物需要共价。Westover 说，这首先需要费力的实验来研究与新配体复合的 Ras 的结构，然后是药物化学的多次迭代。

Westover 承认，一些科学家驳斥了寻找可以与天然 Ras 配体竞争的化合物的想法。“许多 Ras 专家会认为这是一种疯狂的方法，”他说。但他通过指出合作伙伴有支持该策略的理论工作来反驳这种怀疑，而且重要的是，他们已经发表了概念验证实验，表明一种化合物——尽管不是药物——可以竞争 Ras 上的那个位置。

下一个问题

在寻找药物的同时，研究人员正试图弥补他们​​对 KRas 的基本生物学和动态运动的理解中的一些巨大差距——这些知识可能会导致关于如何阻止其活动的新想法。

2013 年，美国国家癌症研究所启动了 Ras 计划，提供 1000 万美元的资金，以支持研究该蛋白质的科学家。在加州大学旧金山分校的 McCormick 的领导下，该计划的目标是开发工具，例如试剂和检测方法，并填补科学领域的一些空白。

Ras 计划的重点之一是在 KRas 的各种突变体与其细胞伴侣相互作用时解决它们的晶体结构。“我们都知道蛋白质会四处移动，但每个人都认为晶体结构是时间和空间的快照，”未参与 NCI 计划的 Nimbus 的 Kapeller 指出。“使用 KRas，我们发现晶体结构非常具有欺骗性。”

McCormick 指出了两种结构，如果得到解决，将使研究人员受益：处于活性状态的 Ras——当 GTP 与突变蛋白结合时——以及当它依偎在细胞质膜上时，Ras 是其功能所必需的位置。“Ras 生物学和化学的未来是了解质膜中的生化和生物物理特性，”他解释说。

参与 Ras 计划的研究人员的目标是今年发布几种与 GTP 结合的突变蛋白结构。与此同时，Nimbus 和其他地方的科学家正在考虑诸如在室温而不是低温下捕获晶体结构等技术是否有助于开发有关蛋白质作用的更有意义的信息。

即使有关各种形式的 Ras 如何工作的细节浮出水面，药物开发人员也知道一些问题只能通过在人体中测试他们的抑制剂来回答。他们希望在未来两年内看到一种或多种候选药物开始临床试验。这将提供关于癌症目标以及是否会出现不利影响——副作用、补偿途径、耐药性——的重要信息。

Kyras 的 Rizzuto 指出，“没有人真正知道最终什么是抑制这一目标的最有效和耐受性最好的”方法。“这是该领域正在努力解决的问题。我们只是不知道，可能直到我们在临床上有好的化合物才能知道。”

尽管关于 KRas 的关键问题的答案非常接近，但研究人员很快强调，KRas 之前已经多次压制了热情。即使是最坚定的吸毒者也承认，现在正在尝试的所有聪明方法都可能像过去一样失败。

这种挑战也是强大的动力。“就像珠穆朗玛峰一样，KRas 值得很多尊重，”Nimbus 的 Nicholson 说。“但我们认为我们有很好的机会。”