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KRAS功能获得性突变发生在大约 30% 的人类癌症中。尽管进行了 30 多年以 KRAS 为重点的研究和开发工作，但尚未发现针对具有 KRAS 突变的癌症的靶向疗法。在这里，我们描述了 ARS-853，一种 KRAS G12C的选择性共价抑制剂，它通过与 GDP 结合的癌蛋白结合并阻止激活来抑制突变的 KRAS 驱动的信号传导。基于对 ARS-853 观察到的参与率和抑制率，以及用于评估 KRAS 激活状态的基于突变体特异性质谱的测定，我们表明 KRAS G12C的核苷酸状态处于动态通量状态，可以由上游信号因子调制。这些研究提供了令人信服的证据，表明KRASG12C突变会产生“过度兴奋”而不是“静态活跃”状态，并且针对非活性的 GDP 结合形式是产生新型抗 RAS 疗法的有前途的方法。
意义：描述了一种细胞活性的、突变体特异性的 KRAS G12C共价抑制剂，其靶向 GDP 结合的非活性状态并防止随后的激活。使用这种新型化合物，我们证明 KRAS G12C癌蛋白快速循环结合的核苷酸并响应上游信号输入以保持高度活跃状态。癌症发现；6(3)；316-29。©2016 AACR。
鉴定在细胞中有活性的共价 KRAS G12C抑制剂。A，LC/MS-MS检测细胞中KRAS G12C小分子结合的方法示意图。接合被观察为相对于对照肽（KRAS/NRAS 残基 136-147）含有 C12 的胰蛋白酶肽（KRAS G12C残基 6-16）的丢失。每个肽都相对于在胰蛋白酶消化后加入的内标（分别为绿色和红色）进行量化。B，KRAS G12C信号强度和 LC/MS-MS 提取离子色谱图（右上）来自对 H358 细胞处理 6 小时后胰蛋白酶消化物的 LC/MS-MS 分析（*，P < 0.05；**，P < 0.01)。C，LC/MS-MS 提取的离子色谱图显示B样品中 KRAS C12 胰蛋白酶肽和 ARS-107 之间的加合物形成。D，从化合物12到ARS-853的化学设计方案。E，KRAS G12C信号强度和胰蛋白酶消化物的 LC/MS-MS 分析，如所示处理 H358 细胞 6 小时（#，P < 0.001）。B – E，误差线，平均值 ± SD（生物重复，n = 3）。F，与 KRAS G12C结合的 ARS-853 的晶体结构突出了 Switch II 口袋中的关键氢键和疏水相互作用。G，用 ARS-853 (MW 432) 处理指定时间的 2 μmol/L KRAS G12C（平均 MW 21,485）的解卷积电喷雾质谱图。ARS-853以依赖于时间的方式与 GDP 加载的 KRAS G12C共价结合，但不与 GMPPNP 加载的主动 KRAS G12C 结合。H，EDTA 介导的核苷酸释放测定，其中 GDP 结合的 KRAS G12C蛋白用指定的抑制剂预先标记，mant -GTP 作为过量的进入核苷酸。I，SOS 介导的核苷酸交换测定，GDP 结合的 KRAS G12C蛋白用指定的抑制剂预先标记，mant -GTP 作为传入的核苷酸。
ARS-853 的细胞活性和选择性。A，ARS-853对处理24小时的H358（G12C）或A549（G12S对照）细胞中KRAS信号传导的影响。B，在 H358 细胞中通过邻近连接测定 (PLA) 进行 ARS-853 (5 μmol/L，4 小时) 处理后 KRAS 和 CRAF 的相互作用。代表性 PLA 图像显示在左侧面板中，白色框区域的高倍放大图像显示在下方图像中。从图像确定的基于每个细胞的 KRAS-CRAF 相互作用的量化 (#, P < 0.001)。单个圆圈代表在三个生物复制孔中量化的单个细胞。C，ARS-853 对处理 24、48 或 72 小时的细胞中 KRAS 信号传导的影响。D，稳定表达 LacZ/TO 或 FLAG-KRAS G12V /TO 的T-REx H358 细胞用强力霉素 (10 ng/mL) 培养 24 小时，随后用 ARS-853 (10 μmol/L) 再处理 24 小时。随后通过蛋白质印迹法监测 RBD 下拉和信号效应。
ARS-853 的细胞活性和选择性。A，在用指定量的 ARS-853 处理前 24 小时，用强力霉素 (10 ng/mL) 培养稳定表达 LacZ/TO 或 FLAG-KRAS G12V /TO 的T-REx H358 细胞。5 天后通过 CellTiter-Glo 监测对细胞生长的影响。B，用 ARS-853 处理 5 天后对贴壁细胞生长（左）或 3-D 超低贴壁细胞生长（右）的影响。C，用 ARS-853 处理 14 天后对软琼脂中不依赖贴壁生长的影响。误差条，平均值 ± SD [分别跨越至少 2 个独立实验 ( B ) 或生物重复孔 ( C )]。D，从显示在软琼脂中的结晶紫染色的集落形成的代表性图像Ç（顶部）和治疗后（底）10天NCI-H2122的放大的代表图像。E，KRAS 敲低或 ARS-853 处理对 2-D 贴壁或 3-D 软琼脂格式的生长的影响。用表达 shLuc 或 sh KRAS 的慢病毒稳定转导的细胞（20,000）在转导后48 小时接种到含有 1 μg/mL 嘌呤霉素的 2-D 贴壁或 3-D 软琼脂格式的培养基中。铺板后 24 小时，用或不用 ARS-853 (10 μmol/L) 处理细胞。在 10 到 14 天后监测生长，并描绘了结晶紫染色的集落形成的代表性图像（另见补充图 S7）。
细胞 G12C 参与的动力学和 GDP 状态选择性抑制剂的信号抑制表明 KRAS G12C在 GTP 和 GDP 结合状态之间的快速核苷酸循环。A，在处理 H358 细胞（圆圈）后 KRAS G12C接合的LC/MS-MS 分析，叠加了基于非线性回归到右侧描述的动力学模型的拟合（线）。动力学模型（右）将 KRAS G12C核苷酸循环的参数与 ARS-853 细胞结合与实验数据的最佳拟合值结合在一起。乙，免疫印迹显示 ARS-853 通过 RBD pulldown (RBD-PD) 对 KRAS-GTP 的动力学和剂量反应，以及对下游 RAS 信号激活标记物 MAPK (pERK T202/Y204) 和 PI3K/mTOR (pAKT S473) 的影响.
KRAS G12C活性的调节改变了 ARS-853 靶标的参与，并支持针对 KRAS 的新治疗策略。A，通过生长因子或小分子抑制剂改变 KRAS-GTP 的示意图。B，在指定时间点收获的用厄洛替尼 (2.5 μmol/L) 处理的 H358 细胞的 RBD-MS 分析。实验数据值用作图 4A（右）所示动力学模型参数的输入。该拟合估计 KRAS G12C上的 GTP 水解速率半衰期为 27 分钟。C、结合 GTP 的 KRAS G12C 的RBD-MS 分析用 EGF（100 ng/mL，1 小时）、厄洛替尼（2.5 μmol/L，2 小时）或曲美替尼（100 nmol/L，24 小时）预处理 H358 细胞后的 WT-RAS（K/N/H 亚型） ）。顶部，用于通过 RBD-MS 测定计算 %RAS-GTP 的公式（详见补充图 S6）。D，在用指定试剂处理的 H358 细胞中，ARS-853（10 μmol/L，1 小时）基于 LC/MS-MS 检测 KRAS G12C靶标参与以改变 RAS-GTP 分数。前处理或共处理条件的顶部、时间和设计：在 ARS-853 加入前 24 小时加入曲美替尼 (100 nmol/L)，在加入 ARS-853 前 1 小时加入厄洛替尼 (2.5 μmol/L)，以及 EGF (100 ng/ml)与 ARS-853 共同处理。#, P与单独的 ARS-853 治疗相比，方差分析 < 0.001。ARS-853 细胞参与的调节与对 GDP 结合的 KRAS G12C 的特定反应性一致。E，来自D中描述的生物复制裂解物的免疫印迹实验。F，ARS-853 处理在有或没有 EGF (50 ng/mL) 的情况下培养的 H358 细胞 5 天的抗增殖作用。G，联合治疗（0.4 μmol/L 厄洛替尼、0.1 μmol/L 阿法替尼或 50 nmol/L 曲美替尼）对用或不用 EGF（50 ng/mL）培养 5 天的 H358 细胞的抗增殖作用。H，在用 ARS-853 与厄洛替尼 (5 μmol/L)、阿法替尼 (100 nmol/L) 或曲美替尼 (100 nmol/L) 组合处理 H358 细胞 24 小时后，免疫印迹评估 KRAS 信号。
